霍乱免疫预防的研究进展

作者:佚名 来源:本站原创 点击数: 更新时间:2008年09月18日

印度恒河三角洲自古以来是霍乱地方性流行区。l9世纪初，由于交通日趋发展，人员、货物等交流逐渐频繁，霍乱也随之向外扩散，传播到世界其他地区。从1817年至1923年的百余年问，先后发生6次世界性大流行。在大流行的问歇期，在一些国家和地区也常有霍乱的发生或流行。由于霍乱具有发病急、病情重、病死率高、传播快的特征，因而是世界各国普遍重视的烈性肠道传染病。1883年Koch在霍乱第5次世界性大流行期问分离到霍乱的病原体霍乱弧菌，这种霍乱病原菌后来被称为古典型霍乱弧菌。1884年，Ferran首次以“减毒”的霍乱弧菌肉汤培养物制备疫苗，在正在发生霍乱流行的西班牙对大约3万人进行胃肠道外接种，以图保护人群。但这种疫苗常引起严重的反应。l9世纪9O年代以后，学者研制了用酚或热灭活的全菌体霍乱疫苗，以胃肠道外的途径接种，用于霍乱流行的控制和预防。埃尔托霍乱原局限于印度尼西亚的苏拉威西岛，1961年5月往外扩散，从而导致第7次霍乱世界大流行。鉴于埃尔托霍乱弧菌和引起前6次大流行的古典型霍乱弧菌的抗原结构、致病机理和临床症状大致相同，因此也广泛使用长期以来用于古典型霍乱预防的全菌灭活疫苗，以胃肠道外的途径对人群进行免疫接种，用于埃尔托霍乱的预防。随后许多学者对霍乱免疫、疫苗的保护效果及新型疫苗的研制等作了大量的工作，本文综述有关的资料。
l传统疫苗的考核
l9世纪9O年代德国学者Kolle研制的灭活全菌体霍乱疫苗及其改进型后来被广泛使用，并被认为是预防和控制霍乱流行必不可少的手段，但对其免疫效果尚未经较严格的现场考核。2O世纪6O～8O年代，在孟加拉、菲律宾、印度尼西亚、印度等国对灭活、全菌体、胃肠道外接种的传统疫苗在大批量人群中进行了有对照的、严格控制的现场考核。其中，1966～1967年在东巴基斯坦对4万名3个月到l4岁的儿童给于一剂或两剂接种，在霍乱8个月流行季节的观察，其免疫效果单剂接种为469／5，两剂接种为649／5的保护力。对5岁以下儿童，单剂接种是无效的，但对较大儿童能产生有意义的保护。两剂接种能增强其对5岁以下儿童的保护作用，但持续时间不超出3个月。1964~1965年在菲律宾对0～7O岁人群进行霍乱疫苗效果考核，每组人群包括试验组和对照组为14．3～l4．8万人，进行单剂疫苗接种，在0～l8个月的观察中，提供的保护力古典型霍乱疫苗为239／5，埃尔托霍乱疫苗为359／5，加佐剂的古典型霍乱疫苗为5O9／5。1973～1975年在印度尼西亚进行每试验组试验和对照人群为15．5～l5．8万人的现场试验，试验人群年龄为l～7O岁，在单剂古典型霍乱弧菌灭活疫苗的试验中，其保护力0～6、7～l2、l3～l8个月分别为5l、359／6、499／6；在加氢氧化铝佐剂的疫苗组中，其保护力分别为73、32、49]。考核的结果各考核点虽不完全相同，但获得的相同结论是：胃肠道外给于l剂或间隔2周的2剂接种，仅能提供约5O的保护，持续时间不超过6个月。由于其保护力不够高，持续时问不够长，不足以使人群产生足够的免疫力来防止发病及带菌状态的发生或改变疾病的严重程度，不能防止霍乱的传播，因此世界卫生组织不推荐使用这类疫苗，从而导致废除在国际问旅行要求霍乱预防接种证明的规定。
2霍乱弧菌感染产生的保护性免疫
霍乱传统疫苗接种产生的保护作用不理想，使人们对霍乱感染能否产生保护性免疫产生疑问，学者对这方面进行了研究。流行病学调查资料表明，在霍乱地方性流行区，霍乱发病率最高的年龄组是2～4岁儿童，以后随着年龄的增大，发病率降低，同时血清中杀弧菌抗体滴度升高。这提示霍乱弧菌临床和亚临床型感染，能使机体产生对该菌的获得性免疫。关于这种免疫力的强度和持续时间，Levine等于1979、1980年在志愿者研究受古典型两个血清型霍乱弧菌感染后获得的保护性免疫，结果，任一血清型霍乱弧菌的初次感染，都能引起对随后同型或异型菌攻击的完全保护，而未经感染的对照组则有89发病，这种良好的免疫少保持3年。1981年Levine等在志愿者的试验证明，埃尔托霍乱弧菌的临床感染也能导致对随后用同型或不同血清型霍乱弧菌再次攻击的有意义的保护，其保护力为9O，而未经感染的对照组有86发病。这些研究结果为霍乱疫苗的研究展示了良好的前景。
3黏膜免疫
黏膜免疫研究的进展为霍乱免疫提示了新的途径。研究证明胃肠道和呼吸道的黏膜，是大多数人类致病菌的侵人门户。B淋巴细胞、T淋巴细胞、浆细胞、和B免疫母细胞、辅助性T细胞、抗原提呈细胞及多种其他免疫细胞聚集在淋巴滤泡内或散布在黏膜上皮内及黏膜下，产生和保持免疫应答。分泌的主要抗体为分泌性免疫球蛋白A(sIgA)，在人类，每日每公斤体重大约分泌40mgIgA，主要在肠道。每日合成的sIgA量几乎为IgG量的2倍。在肠道，淋巴滤泡聚集成滤泡结节，称为PayerSpatches(PP)，在PP的上皮内及黏膜上皮细胞间，存在微皱折细胞(M细胞)，该细胞选择性地摄取和转运病毒和细菌等抗原，并传递给有关淋巴细胞。免疫细胞在肠道受到抗原致敏后，经由淋巴导管进人血循环，逐步分化成熟，约8O归巢到致敏部位的固有层或上皮内，并发育成熟为浆细胞，分泌针对相应抗原的slgA，另外约2O的免疫细胞进人其他的黏膜，发挥免疫效应。通过对霍乱的发病机理及霍乱弧菌的致病因子进行较深人的研究，业巳阐明，霍乱弧菌是非侵人性的病原体，其致病过程包括：①病原菌随饮食通过宿主的胃酸屏障；②在小肠定居和繁殖；③产生致泻的肠毒素，使小肠黏膜的上皮细胞分泌大量水份，导致宿主剧烈的甚至致死性的腹泻。研究FZ3认为，霍乱保护性免疫主要(如果不是唯一的话)是由肠道黏膜局部产生和分泌到肠黏膜表面的sIgA抗体介导的，这些抗体通过抑制细菌的定居和繁殖、封闭肠毒素的活性而起保护作用，已证明在肠腔存在对霍乱抗原的sIgA、IgG和IgM抗体，在保护性免疫方面，肠道的sIgA抗体是最重要的一种。Viret等[g]给予志愿者单剂口服霍乱弧菌CVD103-HgR株重组减毒口服活菌苗，首先发生对全菌苗细胞和纯化的脂多糖的IgM抗体分泌细胞反应，初次免疫后14个月，仍然存在有意义的局部免疫。
4霍乱疫苗的研究
4．1胃肠道外接种的疫苗对过去采用的用酚或热灭活的霍乱弧菌全菌体菌苗，通过胃肠道外途径接种两剂，每剂相隔2周，然后进行现场观察。考核证明，这种疫苗仅能提供5O的保护作用，其保护的持续时间几乎不超过6个月，并且不能防止病原体的传播。因而世界卫生组织已不推荐在人群中使用这种菌苗引。
4．2口服疫苗到2O世纪7O年代中期，由于认识到O1群霍乱弧菌是非侵人性的，并且对肠道免疫系统作用的进一步了解，认识到经口免疫能最大程度上刺激肠道的免疫反应，从而把重点转到口服疫苗的研究上。
4．2．1口服灭活疫苗Svennerholm等1986年报告了口服B亚单位一灭活全菌霍乱弧菌组合疫苗，该疫苗含有1mgB亚单位和1O¨用热或福尔马林灭活的霍乱弧菌，菌体包括了该菌的2个生物型和血清型。在孟加拉6．3万人中对这疫苗进行了随机的、有安慰剂对照的、双盲的现场考核。试验者受到3剂疫苗的接种，两剂间相隔6周。接种的疫苗有加(WC／BS)或不加(wC)B亚单位的全菌，安慰剂为灭活的大肠杆菌K-12。考核的结果，这2种苗是安全的，在接种后的初6个月，WC／BS的保护力为85，WC苗为58。但6个月后B亚单位的增强作用消失，到观察期结束的36个月，其保护作用WC／BS为5O，WC为52。观察到在接种6个月后，对2～5岁儿童的保护作用明显低，仅为23～26，而5岁以上为63～68。对这种疫苗有人作出的评价包括：该疫苗对幼儿的保护作用持续时间较短、对O型血人群保护作用较低、需要多次接种、生产B亚单位和大量灭活的菌体费用较大[-2,11,123，因而使免疫预防所需的经费较多，难以在发展中国家推广使用。目前对这种疫苗有学者提出改进，其改进包括在全菌成分中增加毒素共调节菌毛(TCP)和【)-甘露糖敏感的血凝素(MSHA)抗原的表达。
当前，WC／rBS苗在阿根廷、危地马拉、萨尔瓦多、爱沙尼亚、洪都拉斯、马达加斯加、尼加拉瓜、挪威、秘鲁、和瑞典等国获准使用。在越南曾使用两剂WC灭活疫苗对人群进行经口接种，接种后当地发生8～1O个月的局部暴发，疫苗的保护力为66，其中值得注意的是对1～5岁儿童也有良好的保护作用，其保护力为68。自1997年以来越南在霍乱地方性流行区对O1群和O139群霍乱弧菌灭活全菌双价苗进行大批量的随机、双盲有安慰剂对照的现场试验，但其保护作用尚未见报道[2]。
4．2．2环境无毒株口服疫苗在印度和巴西外环境分离到无肠毒素原的O1群霍乱弧菌，在印度和美国的志愿者试验了其作为活的口服疫苗时的保护作用，结果是使人失望的，虽然这些菌株没有什么副作用，但其在小肠的定居力很差，仅引起极微弱的血清学反应，最重要的是，于志愿者在有对照的实验攻击试验中，环境株不提供保护作用。于永茂等。从环境检出的无CT基因的埃尔托霍乱弧菌中，选育出1株噬菌体一生物分型属流行株，为小JI『1a，免疫原性好的菌株。祁国明等研究了这株菌的生物学、遗传性状及其免疫力，并进行了安全性试验和口服后的免疫应答。结果表明，该菌无毒，口服后可以引起人体产生抗霍乱弧菌IgA抗体，持续时间一年以上。
4．2．3基因重组口服活疫苗Forrest等将编码霍乱弧菌O抗原的基因重组人减毒伤寒杆菌Ty21a内，并获得表达。在澳大利亚和北美志愿者对这株候选疫苗菌株进行人体试验，结果仅提供25的保护，但能降低腹泻的粪便量和减少排菌。张树波等[1。将编码霍乱弧菌O抗原的基因转人缺乏尿苷二磷酸半乳糖差向异构酶的鼠伤寒沙门菌无毒突变株G30株内，获高效表达，构建出霍乱／鼠伤寒两价候选疫苗株VM90，经凝集试验测定，其表达的霍乱O抗原量与其基因来源的母株一致。刘端等[1以小鼠为模型研究了经口灌喂VM90的免疫效果，结果在观察的一年内，从肠液和血清可查出特异性抗体。张纪忠等口胡应用候选疫苗株VM90经口灌喂小鼠，观察初次免疫和第二次免疫后小肠、集合淋巴结、肠系膜淋巴结、肝、脾中特异性浆细胞的免疫应答，结果表明，VM90能引起良好、持久的免疫应答，再次免疫能很快出现特异性浆细胞反应。高庆申等组建了含编码霍乱弧菌O抗原和CT—B的克隆子，经乳鼠和兔肠保护试验表明，对受霍乱弧菌和CT攻击的试验动物有良好的保护作用。马清钧等[2叩将含有克隆到的CT—B重组质粒转移至减毒的伤寒菌株Ty21a内，构建出稳定产生CT—B的重组株，作者应用这一重组株与灭活的霍乱弧菌全菌组成二价候选疫苗，经小鼠腹腔免疫接种，免疫动物能耐受伤寒杆菌毒株、埃尔托霍乱弧菌毒株和霍乱肠毒素的攻击。
4．2．4重组DNA技术研制的减毒活疫苗株以重组技术使霍乱弧菌中编码CT—A(A—B+)或全CT的基因缺失(A—B一)，曾先后构建了多株疫苗候选株。曾用未查出类志贺毒素的古典型霍乱弧菌569B株通过基因工程技术使CT—A1缺失94，使其失去肠毒素的生物活性，从而构建了CVD103(A—B+)株，随后对该CT—A1缺失株用汞抗性基因插人染色体中hlyA所在位置，构建出CVD103一HgR，使其与O1群霍乱弧菌野生株相区别。对CVD103一HgR的安全性及免疫原性，在美国、瑞士、泰国、印度尼西亚等多个国家进行了4000多人的随机、有安慰剂对照的、双盲试验，证明是安全的。在北美，给成年志愿者口服单剂5×10cfuCVD103一HgR，结果有92志愿者的血清杀弧菌抗体滴度呈4倍或4倍以上的升高。在北美志愿者进行攻击试验来研究其保护作用，对受到野生型O1群霍乱弧菌毒株攻击而发生重(总粪便量≥5．0升)、中(粪便量3～5升)型腹泻的志愿者，能给予完全的保护。对包括各型腹泻的总体保护作用，用古典型霍乱弧菌攻击时，保护作用为82～100；用埃尔托霍乱弧菌攻击时，保护作用为62～67。CVDHgR疫苗产生的保护作用较快，免疫后7d即可产生完全的保护，至于接种菌苗产生保护性免疫的持续时间尚未确定，但至少为6个月[1。。。Tacket等[2以没有got、Ace和溶血素等毒素的埃尔托霍乱弧菌小JI『血清型E7946株为出发菌，使其缺失CT—A和具有汞抗性，构建出候选疫苗株CVD110，给志愿者口服量为10cfu，对照组口服缓冲液。口服后免疫组血清的杀弧菌抗体升高，其滴度对tJ,,Ji『型为1：10240～1：20480，对稻叶型为1：80～1：20480，提示CVD110具有良好的免疫原性，但口服CVD110的10人中7人发生腹泻。试验结果表明，CVD110具有强的免疫原性，但尽管已缺失己知的肠毒素，可能存在其他未知的毒素或定居因子与腹泻有关。
5世界卫生组织对接种霍乱疫苗的主张
5．1传统的胃肠道外接种的灭活全茵体疫苗保护作用低保护持续时间短，因而不推荐使用这种疫苗。
5．2WC／rBS和CVD103-HgR疫苗是安全和没有重要副作用的和古老的疫苗相比，这些较新研制的口服疫苗提供较好和持续时间较长的保护作用。然而由于对2岁以下儿童的保护作用不足，因而这些疫苗排除在国家婴幼儿免疫计划之外。
5．3预防霍乱暴发仅在实施世界卫生组织推荐的其他预防和控制措施后安排疫苗接种。在紧急情况下，对居住在简陋帐蓬的难民、和城市贫民区的居民等高危人群应进行免疫接种。
5．4在新一代的霍乱疫苗中，仅WC／rBS疫苗在现场证明其保护作用在存在霍乱流行高危人群时，应考虑接种WC／rBS苗。但由于wC／rBS苗需接种两剂，两剂间相隔要1周以上。在紧急状态下可推荐使用CVD103一HgR疫苗，这种疫苗在地方性流行区曾证明是有效的。
5．5对到霍乱高危流行区的旅游者可推荐使用wc／rBS或CVD103一HgR疫苗如果时间紧迫，推荐使用CVD103一HgR疫苗，这种疫苗单剂免疫后7d即可产生保护性免疫。
6新型霍乱疫苗进一步研制的展望
霍乱弧菌目前发现至少有155个O血清群，其中O1群和O139群能引起霍乱的流行。O1群霍乱弧菌引起的第7次世界性霍乱大流行自1961年开始以来已波及全球五大洲140个以上的国家和地区，至今尚无停息的迹象。1992年开始的0139霍乱仍在亚洲一些国家和地区流行，这一血清群作为霍乱病原，对全球、尤其对亚洲的威胁依然存在，应对其给予足够的关注。目前推荐的2种霍乱口服疫苗，主要是针对O1群霍乱弧菌的。虽然O1群和0139群霍乱弧菌所产的肠毒素大致相同，抗毒免疫有交叉保护作用，但其O抗原免疫原性不同，抗菌免疫没有交叉保护作用，而抗菌免疫是重要的保护性免疫，因此有必要研制含有两型菌菌体保护性抗原的疫苗。
构建的霍乱口服活疫苗如包含有较全面的主要保护性抗原，选用的载体菌合适，无致泻或其他致病性，能在小肠较长时间定居、繁殖，使肠道免疫系统接收到足够量抗原的刺激，有可能产生与霍乱自然感染相似的免疫效果，同时这类疫苗用量少，生产、储存、运输、使用方便，具有减少免疫预防费用的优点。
用基因工程技术消除具有良好免疫原性菌株的毒素因子，其余的抗原不发生缺失，从而构建出无毒、免疫效果良好的菌苗菌株，是研制新型菌苗的重要途径。在研制这种菌苗菌株时，要对所用菌株的毒素因子有较全面、彻底的了解，并使其编码基因缺失，以避免服用后腹泻等副反应的发生。

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