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（必存）依达拉奉对肺缺血再灌注损伤保护作用的实验研究

作者:佚名 来源:互联网 点击数: 更新时间:2008年02月12日

作者：周庆玲 吴建文

《山东大学学报（医学版）》2007年2月45卷2期 文章

 
【摘要】  目的：通过建立兔在体肺热缺血再灌注模型，探讨依达拉奉对兔实验性肺缺血再灌注损伤的影响及作用机制。方法：采用兔肺原位热缺血再灌注损伤模型进行研究。24只大白兔随机分为三组：①　对照组(C组, n=8),开胸后不阻断肺门，静脉缓慢推注生理盐水5?ml/kg； ②　缺血再灌注组(I/R组, n=8),左肺接受60?min的缺血，然后接受60?min再灌注，于缺血前5?min静脉缓慢推注生理盐水5?ml/kg；③　依达拉奉干预组(E组, n=8)，于缺血前5?min静脉缓慢推注依达拉奉10?mg/kg（5?ml/kg），左肺接受60?min的缺血，然后接受60?min再灌注。120?min实验结束时，留取各组动物血液标本,测定血浆丙二醛（MDA）含量及超氧化物歧化酶（SOD）活性；收集支气管肺泡灌洗液（BALF），检测支气管肺泡灌洗液中白细胞计数、中性粒细胞百分比及肺通透性指数；留取肺组织标本，测定肺组织湿、干重量，计算干／湿重比（D/ W）及行肺组织病理检查。结果：I/R组血浆丙二醛含量、支气管肺泡灌洗液中蛋白含量、支气管肺泡灌洗液中WBC总数及中性粒细胞百分比明显高于C组及E组（P＜0.01），E组与C组比较，无统计学意义(P＞0.05)； I/R组血浆SOD活性、血清蛋白含量及肺组织干／湿重比（D/W）较C组及E组显著降低（P＜0.05），E组与C组比较，无统计学意义(P＞0.05)；肺通透指数I/R组明显高于E组与C组（P＜0.01），E组显著高于C组（P＜0.05）；肺组织病理显示，E组肺泡内出血、炎性细胞浸润、渗出及间质水肿均较I/R组为轻。结论：依达拉奉通过清除氧自由基、抑制脂质过氧化，对兔肺原位热缺血再灌注损伤有一定保护作用。

【关键词】  依达拉奉 氧自由基 缺血再灌注损伤

     体外循环心脏直视手术以及肺移植等心胸外科手术后，早期的肺缺血再灌注损伤(lung ischemia reperfusion injury)是患者术后发生肺功能不全导致死亡的主要原因［1］。肺缺血再灌注损伤的重要原因之一就是氧自由基形成。依达拉奉(edaravone，3甲基1苯基2吡唑啉5酮)是一种新合成的自由基清除剂，通过清除自由基，抑制脂质过氧化，对多种脏器及组织的缺血再灌注损伤有保护作用。本研究拟通过建立兔在体肺热缺血再灌注模型,探讨依达拉奉对肺缺血再灌注损伤的作用及机制。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  健康新西兰大白兔24只，雌雄不拘，体重2?500 3?000?g,购于山东大学医学院实验动物中心。

    1.2  动物模型制备  兔经耳缘静脉建立静脉通路，静脉注射氯胺酮2?mg/kg，氯化琥珀胆碱1?mg/kg，麻醉后仰卧位固定于手术台。颈部正中切口，气管切开插管，接E150型纽邦（NEWPORT）呼吸机辅助呼吸，吸氧浓度21%，呼吸频率40 50次/分，潮气量双侧肺通气15 20?ml/kg, 单侧8 10?ml/kg。在胸正中偏左于第3、4、5肋间开胸，离断左侧肺下韧带，游离左肺门穿过阻断带备用，静脉注射肝素3?mg/kg抗凝。按Sekido′s法复制在体兔肺热缺血再灌注模型，即呼气末阻断左肺门的血管和支气管，终止左肺血供及通气60?min，然后开放左肺门再灌注60?min。　

    1.3  实验分组  ① 对照组(C组, n=8),开胸后不阻断肺门，静脉生理盐水5?ml/kg； ② 缺血再灌注组(I/R组, n=8),左肺接受60?min的缺血，然后接受60?min再灌注，于缺血前5?min静脉滴注生理盐水5?ml/kg； ③ 依达拉奉干预组(E组, n=8)于缺血前5?min静脉滴注依达拉奉10?mg/kg，左肺接受60?min的缺血，然后接受60?min再灌注。120?min实验结束时留取各组动物血液标本，离心取血清置-20?℃冰箱保存待测。放血处死动物后每组半数动物取下左肺行左肺支气管肺泡灌洗。从左支气管缓慢注入生理盐水10?ml，轻轻震动左肺，回收，反复灌洗2次，支气管肺泡灌洗液(BALF)4?000?r/min(离心半径11cm)离心10?min，取上清液检测蛋白含量。另半数动物取肺组织标本测干／湿重以及送病理检查。

    1.4  测定指标及测定方法

    1.4.1  血清丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶（SOD）测定  MDA测定采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid,TBA)法；SOD测定方法为黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)。              

    1.4.2  支气管肺泡灌洗液中白细胞（WBC）计数、中性粒细胞（PMN）百分比及肺通透性指数测定  采用双缩脲法测定血清及支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白质浓度，BALF中蛋白质浓度与血清蛋白浓度之比为肺通透性指数。BALF沉渣作白细胞计数及分类。

    1.4.3  肺组织干／湿重比（D/W）测定  实验结束时，取1?g左右左肺组织用分析天平称重为湿重，置于70?℃电热恒温干燥箱中烤48?h后称重为干重，干重与湿重之比即为肺干湿重量比(D/W)。

    1.4.4  肺组织光学显微镜检查  取左肺下叶约1?cm×1?cm×1?cm大小组织块，用10%福尔马林固定,予以常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察形态学改变。

    1.5  统计学处理  结果均以±s表示，所有统计学处理采用SPSS11.0软件完成，组间比较采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  血浆丙二醛(MDA)含量及SOD活性  见表1。由表1可见，与正常对照组及依达拉奉组相比，肺缺血再灌注组血浆MDA含量显著增加（P＜0.01），SOD活性显著降低（P＜0.01），而依达拉奉组与正常对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

    2．2  肺通透性指数及支气管肺泡灌洗液中白细胞计数、中性粒细胞百分比  见表2。由表2可见，与正常对照组及依达拉奉组相比，肺缺血再灌注组支气管肺泡灌洗液中蛋白含量、WBC总数及中性粒细胞百分比显著增加，血清蛋白含量显著降低（P均＜0.01），而依达拉奉组与正常对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)；肺通透指数，I/R组明显高于C组及E组（P＜0.01），E组显著高于C组（P＜0.05）。

    2．3  肺组织干／湿重比（D/W）  肺缺血再灌注组D/W为0.188?7±0.002，较正常对照组（0.203±0.002）及依达拉奉组（0.196?8±0.002）显著降低（P＜0.05），依达拉奉组与正常对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

    2．4  肺组织病理结果  正常对照组肺泡腔完整，肺泡间隔均匀一致，壁光滑，肺泡腔内无渗液或少量渗出白细胞（图1）。肺缺血再灌注组肺组织毛细血管明显扩张、充血，白细胞附壁，肺泡间隔明显增厚，大量白细胞渗出、聚集，肺泡腔中可见明显出血、渗出，部分肺泡萎陷不张（图2）。依达拉奉组肺组织毛细血管轻度充血，肺泡结构尚可，肺泡间质粒细胞浸润及肺泡腔出血、渗出较缺血再灌注组明显减轻（图3）。

    3  讨  论

    随着心脏手术、器官移植、心肺脑复苏措施的深入开展,体外循环技术在临床上的应用日益增多。然而，心脏手术、肺移植等心胸外科手术后的肺缺血再灌注损伤(lung ischemia reperfusion injury)依然是该领域需要探索的课题。

    缺血再灌注损伤（ischemiareperfusion injury，IRI）是指各种原因引起组织缺血后，经血管疏通或血管再造使组织获得血液的再灌注，在一定情况下，这种再灌注反而会导致组织细胞更加严重的损伤。缺血再灌注损伤的机制尚未完全清晰，但与炎性介质、内皮细胞损伤、能量耗竭与产能障碍、无复流现象、钙超载、氧自由基损伤等机制有关。

    近年研究证实，氧自由基和活性氧在再灌注损伤中起主要作用。在缺血再灌注损伤过程中氧自由基(OFR)如:超氧阴离子(O-2)、过氧化氢(H2O2)、次氯酸(HOCl)等是重要的致伤因素。正常情况下，机体产生少量的自由基，由于机体有“抗氧化防御体系”，不致对机体造成大的危害。然而，当机体缺血缺氧后，抗氧化体系受到抑制，补体、多形核白细胞激活，再灌注时的氧供，使OFR呈爆发性增加。自由基有极为活泼的反应性，能和各种细胞成分（膜磷脂、蛋白、核酸）发生反应。缺血再灌注时产生的氧自由基对组织的损伤包括：① 导致脂质过氧化,损伤生物膜（包括细胞膜、溶酶体膜、线粒体膜、核膜等）。膜脂是构成膜脂质双层的重要结构及功能成分，富含不饱和脂肪酸，自由基与不饱和脂肪酸作用引发脂质过氧化（lipid peroxidation）反应从而改变它们功能，由于脂质过氧化反应的增强，细胞膜内多价不饱和脂肪酸减少，膜的液态性、流动性改变，通透性增强。含双键脂肪酸过氧化可生成丙二醛，它的产生与脂质过氧化相平行，因而测定丙二醛含量可代表脂质过氧化物的浓度，丙二醛水平的高低可以间接反映出机体细胞受自由基攻击的严重程度。丙二醛反应可介导各种交联反应，形成脂质自由基；② 自由基对蛋白质的影响。在自由基的作用下，胞浆及膜蛋白及某些酶可交联成二聚体或更大的聚合物。蛋白质的交联将使其失去活性，结构改变。自由基也能催化氨基酸氧化、蛋白质-蛋白质交联和蛋白质链的断裂破坏蛋白质和酶,可使蛋白质分子聚合、交联、断裂，使蛋白质变性、酶活性降低；损伤DNA,使DNA链断裂，并可与碱基发生加成反应，导致染色体断裂和畸变；破坏间质,使细胞间的透明质酸降解，胶原蛋白变性、交联，从而使细胞间基质疏松，弹性降低。SOD是机体的内源性抗氧化剂，对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，因而SOD活性水平的高低能间接反映机体清除自由基的能力。我们的实验结果表明，肺脏缺血再灌注后血浆SOD 活性降低，而丙二醛含量增加，表明肺缺血再灌注后内源性氧自由基清除系统迅速消耗,肺组织内OFR 的产生与清除的动态平衡遭到破坏,从而导致肺内OFR 增加,破坏肺内皮细胞及细胞器膜结构和功能,最终引起肺水肿、出血、渗出等损害。

    肺缺血再灌注损伤的病理表现主要在以下三个方面:① 对代谢的影响。与心脏相似，ATP含量更加减少，肺泡表面活性物质生成减少，乳酸更进一步增加，DNA合成减少;② 对肺功能的影响。肺动脉高压，非心源性肺水肿，肺淋巴回流增加（淋巴液中蛋白含量先低后高），肺顺应性降低，低氧血症，肺内分流量增加，导致肺移植或CPB后的急性肺功能不全，ARDS；③ 形态学改变。双肺弥漫性肿胀、充血，肺间质水肿、出血，大量富含蛋白的液体漏入肺泡腔（有时可见透明膜形成），肺泡萎陷、肺不张；镜下见肺泡Ⅰ型上皮细胞胞浆肿胀、破裂，Ⅱ型细胞板层小体（储存表面活性物质的场所）消失，毛细血管内皮细胞的胞浆、线粒体、内质网和细胞核肿胀，基底膜水肿，气血屏障增厚乃至破坏。本研究中的肺组织病理学检测结果表明，肺缺血再灌注后肺泡及肺间质水肿，小血管扩张、充血，肺泡内出血及炎性渗出。支气管肺泡灌洗液检测也证实了有大量富含蛋白的液体漏入肺泡腔，肺泡内大量炎性细胞浸润。

    近年，众多学者对缺血再灌注损伤防治进行了大量研究。研究内容包括对导致组织缺血再灌注损伤的各环节进行干预：尽量避免和减少缺血的发生；缺血期间的低温及药物保护；减轻细胞内钙超载；抑制中性粒细胞炎症反应，减少炎性因子的产生；减少自由基的产生及自由基清除剂的使用等。

    依达拉奉是一种自由基清除剂，具有自由基清除和抑制脂质过氧化的作用，可以抑制脑细胞(血管内皮细胞和神经细胞)的过氧化作用，延迟神经细胞死亡，减轻脑缺血以及脑缺血引起的脑水肿和组织损伤。新近的研究还显示，依达拉奉可通过预防线粒体过氧化应激和改善肝脏缺血后再灌注时的能量代谢，保护线粒体免受损伤，并预防内毒素引起的肝损伤, 减少细胞凋亡；且对小肠、心脏、肾脏及肢体缺血再灌注损伤有保护作用。国外已有学者开始对依达拉奉的肺保护作用进行探索。Ito等就依达拉奉对鼠肠缺血而致的肺损伤有无保护作用进行了研究。因为肠缺血再灌注可致远端器官功能障碍，且常累及肺脏，呼吸衰竭是常见并发症，也是致死的主要原因。Ito的研究表明，依达拉奉能减少肠缺血再灌注后肺部白细胞浸润，减轻脂质过氧化，抑制肺内致炎性细胞因子IL6 mRNA 表达。肺组织学检查也显示了其保护作用。

    本研究通过建立兔在体肺热缺血再灌注模型对依达拉奉对肺缺血再灌注损伤的作用及机制进行了探讨。结果显示，在肺脏缺血前静脉注射依达拉奉能降低再灌注后血浆丙二醛的含量，提高超氧化物歧化酶的活性，减少肺组织内SOD 消耗,有效地抑制OFR生成和膜脂质过氧化，减轻肺泡内及肺间质中的渗出和水肿。且肺组织D/ W比值的变化也表明依达拉奉可有效地减少再灌注后的肺水含量,同时，从肺组织病理观察中可见，肺充血、出血、渗出和炎症细胞浸润等缺血再灌注损伤明显减轻。

    我们的研究结果提示，依达拉奉通过清除自由基，抑制脂质过氧化，对在体肺热缺血再灌注损伤有保护作用。但对于该药用于防治肺缺血再灌注损伤的剂量、给药途径及给药时机尚需进一步探讨。

 

 

药品名称
通用名
生产厂商
药品规格
单位
价格(元)
南京先声东元制药有限公司
5ml:10mg/支*6支
支
78

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