卵巢癌耐药性研究进展

虽然卵巢癌的发生率在女性肿瘤中仅是第7位，接近60％的患者最终死于这一疾病。在2002年，仅在美国，有23300新发病例被确诊，13900例死亡报道。虽然乳腺癌的发生率明显高于卵巢癌(203500新发病例)，它的死亡率与卵巢癌相比却相当低(39600死亡病例；接近2O％死亡率)一1。实际上，卵巢癌在女性生殖系统肿瘤中死亡率是最高的。卵巢癌的治疗未能取得更好的效果，很大程度上是因为诊断的时候疾病已是晚期。仅仅25％患者在诊断的时候肿瘤仍局限于卵巢。在晚期(III期和IV．期)患者中，肿瘤超出卵巢的范围，因此治疗效果更差。

1细胞凋亡与卵巢癌
当前，卵巢癌的首选治疗方案是联合化疗，通常是以铂类为主，例如顺铂或卡铂，联合以紫杉醇。虽然这一治疗方案在很多病例中都有较好的疗效，但耐药性的发生明显降低了治疗的成功率。肿瘤细胞对化疗药物的反应与凋亡机制相关。此外，普遍认为，药物引起的肿瘤凋亡，不但由凋亡因子或者肿瘤抑制因子的上调控制，也由细胞生存因子的调制所控制。多种参与诱导或抑制凋亡的基因，比如P53基因，Akt基因，和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)基因家族，在卵巢癌细胞中受到异常调节。因为他们有多种生物学效应，这些因子中一个或多个的异常将引起药物诱导细胞凋亡的失败。这一综述略述了一些与控制细胞存亡有关的主要的调节途径，阐述了一些新近发现的这些凋亡调节因子之间的相互作用，并说明了这些相互作用对化疗耐药性是如何重要，最后探讨了在此领域未来的研究中可能的方向。用于治疗人类肿瘤的化疗药物，其疗效很大程度上依赖于肿瘤细胞发生药物诱导性凋亡的能力。研究人员广泛认同在一个特定的药物作用下细胞的存亡，是全面的凋亡平衡在这一特定细胞中的反映。例如，顺铂在某几种类型的肿瘤细胞中上调凋亡因子p53，Fas，和Bax。。。但是，它也下调某些特殊的细胞生存因子例如Xiap和Akt[引。最近的资料显示化疗耐药性可能也代表了这两种现象的平衡失调。凋亡是一个对细胞的正常发展和阻止异常细胞生长有重要作用的机制。阻止不正常的细胞死亡需要特定的细胞生存因子。为了阐明卵巢癌的细胞耐药机制，我们检验了许多新发现的细胞生存蛋白质，作为潜在的化疗敏感性决定因素。以下列出其中几个。2参与凋亡控制的几个重要基因与耐药的关系
2．1X连锁凋亡抑制蛋白(Xiap)
凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosiSprotein，IAPs)是一类在结构上具有同源性的细胞内源性凋亡抑制蛋白家族。人类IAPs的主要成员有x连锁凋亡抑制蛋白(X—linkedinhibitorofapoptosiSprotein，XIAP)、CIAP1、CIAP2、生存素Survivin、livin、神经元凋亡抑制蛋白NIAP等]。Xiap是IAP家族中最有效力的胱冬肽酶(CasPase)抑制物，也是分子结构研究得最清楚的IAP家族成员。
XIAP基因定位于Xq25，mRNA全长为9kb，但实际编码区仅有1．5kb。xIAP分子量57kD，主要由3个杆状病毒IAP重复序列区(baculOViralinhibitorofapoptosisrepeat，BIR)和一个RING锌指结构域(RINGZnfingerdomain)组成。XIAP的N一端有3个BIR结构域：BIRl、BIR2和BIR3。BIR结构域是IAP家族分子抑制caspase活性，发挥凋亡抑制作用不可缺少的结构。XIAP的C端有1个RING锌指结构域，具有泛素连接酶E。活性，也是IAP家族分子抗凋亡的重要结构。XIAP分子N端的3个BIR结构域可以结合并抑制caspase一3、caspase一7和caspase一9，但是不能直接抑制caspase一1、caspase一6、caspase一8或caspase一10。XIAP的C端的RING锌指结构具有E。泛素连接酶活性，通过泛素蛋白酶体途径可以促进XIAP自身或与其相互作用的蛋白分子泛素化。XIAP既通过BIR结构域抑制caspase活性，也通过RING结构域催化caspase泛素化降解，从而阻止多种因素诱导的细胞凋亡。根据Li等人的文献报道，顺铂在卵巢癌化疗敏感细胞中下调xiap，在耐药细胞中则不然强]。Xiap是化疗耐药的决定因素之一，若Xiap在肿瘤细胞中下调，则细胞对顺铂的细胞毒作用敏感，而Xiap在肿瘤细胞中的过度表达则会导致化疗耐药[s，。
2．2PI3K／Akt信号转导通路
PI3K(磷脂酰肌醇一3一激酶)与Akt(蛋白激酶B)是促进抗细胞凋亡作用的重要调节因子，其过量产生可抑制细胞的凋亡，该过程可能与细胞的转化与肿瘤的发生有关，如肿瘤抑制因子PTEN。敲除了PTEN基因的鼠对凋亡的敏感性降低。同时，Kennedy等发现，Akt激酶区活化时，细胞能抵抗渥曼青霉素诱导的细胞凋亡作用，而激酶区突变失活的Akt蛋白的细胞则不能抵抗渥曼青霉素诱导的细胞凋亡作用，证明具有完整激酶活性区的Akt才能促进抗细胞凋亡作用。
PI3K-Akt通路通过多种途径来调节细胞的存活。Akt对细胞存活的调节可通过抑制促凋亡因子的活化，如Bad、CaSpaSe一9。另外，Akt调节促凋亡蛋白的表达，如Fas配体与BIM，机制是抑制Forkhead家族转录因子AFX与FKHRIl。另一方面，Akt是caspase一3的作用底物，Akt对此的清除能导致存活信号的活化。PI3K—AKT抗凋亡作用可能涉及以下几种机制：①抑制胱冬肽酶(Caspase)的活化：降低培养细胞的血清浓度能使Caspase一3和Caspase一9活化提高，导致其底物多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的降解，从而诱发细胞凋亡。激酶区活化的Akt的细胞中，可发现该过程被抑制。②影响葡萄糖的新陈代谢：如抑制糖原合成酶激酶-3(GSK-3)的活性及促进葡萄糖转录因子(GLUT)的合成。在成熟细胞中，GSK的活化可活化肿瘤样结肠息肉(APC)蛋白，使细胞骨架蛋白B—catenin降解及细胞粘附抑制，加速细胞凋亡。此外，在生长因子撤退的细胞中，Akt的持续活化引起的抗凋亡效应包括GLUT的转录且GLUT在细胞表面的表达增强。GLUT使葡萄糖的吸收能力增强，且糖酵解速度增加，从而葡萄糖氧化生成的ATP水平提高。因此，Akt可通过加快新陈代谢而阻止细胞凋亡。但GLUT并不能维持持续的细胞存活。③调节Bc卜2家族成员的活性：Bc卜2家族分为促凋亡基因与促存活基因。Bc卜2，Bc卜Xl等蛋白可促进细胞生长，而Bc卜Ks，BAD，BAX等则促进细胞死亡。Bc卜2家族同质二聚体或异质二聚体的形成及平衡是决定细胞死亡与生存的关键。BAD是Akt的直接底物，Akt是强有力的Bad—Ser136激酶。PI3K依赖性的Akt的激活可使BAD的Serl36位点磷酸化，有效阻断Bad诱导的细胞死亡。磷酸化的Bad能与14—3—3(一种抗凋亡蛋白)蛋白相互作用，释放Bc卜2，抑制细胞凋亡。如Bad-Serl36位点突变，Bad不能被磷酸化，而与Bc卜xL或Bcl一2结合，形成Bax同质二聚体，诱导细胞死亡。⑤防止线粒体释放凋亡因子：线粒体可释放细胞色素C及调亡诱导因子(AIF)，参与细胞凋亡。Akt可阻止线粒体释放细胞色素C，抑制细胞调亡。⑥影响转录因子：如活化NF—KB，抑制forkead家族转录因子FKHRL—l，从而加快细胞周期进程。⑦活化IAP家族蛋白：如生存素。在CD28细胞中，PI3K／Akt活性的抑制可阻断生存表达的上调，从而阻断细胞周期进程。虽然有多种途径，但谁是主要途径还不清楚，因为至今为止，还不能建立一个转基因动物来验证它。最近有证据表面，PI3K／Akt信号转导通路参与对抗多种抗肿瘤药物。表达活化Akt2的细胞对顺铂耐药[。，㈨]。此外，也有报道指出活化的PI3K催化亚基能使卵巢癌细胞对紫杉醇耐药，而且这一结果能被PI3K的抑制剂LY294002所逆转⋯]。在这一研究中，被移植了卵巢癌细胞的裸鼠接受紫杉醇和LY294002的治疗，它们有协同作用，减少肿瘤负荷达80％，提示抑制PI3K／Akt信号转导通路是对传统化疗的潜在的有效辅助。
2．3局部粘着斑激酶(FAK)
粘着斑激酶(focaladhesionkinase，FAK)是整合蛋白介导的信号转导中的重要成员，有酪氨酸蛋白激酶活性，并可自身磷酸化。新近发现FAK可抑制细胞凋亡，FAK本身是胱冬肽酶(caspase)的底物。作为信号分子的FAK，还与细胞内其他信号转导通路存在串话(crosstalk)，直接参与了细胞多种功能的调节。
FAK本身是一个分子量为125kD的酪氨酸激酶，它缺乏跨膜区，似乎是一个纯粹的细胞质酪氨酸激酶，但又不含胞质酪氨酸激酶和其他生长因子受体作用蛋白质常有的SHz和SH。结构域，可见FAK结构之特殊性，其归类还悬而未决。已发现FAK分子中397和925位的酪氨酸残基可被磷酸化，其活性随整合蛋白在细胞膜表面聚集而升高。这种整合蛋白诱导的FAK磷酸化主要依靠亚基的胞内结构域，也即整合蛋白成簇排列后，其亚基胞内结构域的信息使FAK激活。此外，瞬间Ca离子浓度升高及PKC活性升高也可协助促成FAK磷酸化而活化。FAK~B近C端有一序列能与聚焦粘附部位趋近，称聚焦粘附靶标(focaladhesiontargeting，FAT)序列，桩蛋白(paxillin)也与FAK中C端的一个序列结合。而在体外实验中FAK邻近N端的序列可与数种整合蛋白亚基胞内结构域的人工合成肽结合。这些结合都使FAK分子与聚焦粘附部位接近。然后FAK分子中磷酸化酪氨酸位点与含SH2结构域(即Src同源序列2，能专一地与蛋白质中含磷酸酪氨酸的模体结合)的胞内蛋白质结合。通过这些复杂的相互作用，以FAK为中心的整合蛋白介导信号转导得以起始。尽管FAK的确切功能尚不清楚，但若干实验均提示FAK可能有两个作用，一是在细胞铺展和移动时，FAK参与粘着斑形成和调节；二是FAK参与信号转导过程，以告知细胞核其细胞已锚定了。近年有关FAK在细胞凋亡中的作用也业已肯定。
人们发现多种肿瘤细胞中FAK活性显著增加。这种FAK活性上升是否与肿瘤细胞凋亡受阻有关，引起了关注。去除细胞粘附可间接抑制FAK活性，进而诱导细胞凋亡。最近应用阻断FAK参与粘着斑作用方法，直接证明了FAK参与抑制细胞凋亡。按FAK分子中一段能与整合蛋白亚基C端结合的顺序，人工合成一个竞争性多肽，或制备抗FAK分子中粘着斑靶标(focaladhesiontargeting，FAT)序列的单抗，分别将二者用微注射技术引入成纤维细胞，即竞争性多肽占领整合蛋白亚基C端，FAK不能参与下游信号转导，最终都导致细胞凋亡。这说明即使细胞发生粘附，粘着斑也存在，只要胞内FAK功能被阻断，细胞同样发生凋亡。此外用转染技术使细胞过表达FAK，也直接证明了FAK可抑制细胞凋亡。总之，细胞锚定依赖是细胞生存并逃逸凋亡的条件之一，其中包括细胞粘附、粘着斑形成、FAK激活、FAK下游信号进一步转导直至细胞核等一系列复杂过程，因此设法抑制肿瘤细胞FAK活性，将是治疗肿瘤的又一新探索途径。最近发现FAK也是胱冬肽酶底物。用TNF—a家族成员Fas或Apo-2L诱导T细胞和肺癌细胞凋亡时，发现活化的胱冬肽酶可水解FAK。Apo一2L诱导T细胞凋亡2h时，FAK即被水解释放出85kD的FAK片段，4h释放出77kD的FAK片段，24h时85kD片段消失，77kD仍存在，此种FAK的水解可被半胱氨酸蛋白酶抑制剂阻遏。在体外，进一步观察到FAK对各种胱冬肽酶的敏感性是不同的。胱冬肽酶3和7能水解FAK并产生85kD片段但不产生77kD片段；而胱冬肽酶6仅能水解FAK产生77kD。所以在凋亡的不同时相，多种胱冬肽酶作用于FAK，以去除FAK抑制凋亡的作用，使细胞最终凋亡。可见，FAK活性的调控直接影响细胞凋亡，是细胞凋亡研究中又一值得重视的环节。2．4线粒体Prohibitin蛋白Prohibitin是一种广泛存在于细胞内的、高度保守的、有着多种生物活性的蛋白，在细胞膜、细胞质、细胞核和线粒体中均有分布，可以通过抑制E2F的转录活性来抑制凋亡通路的传导[1引，同时也可以通过诱导p53的活性抑制凋亡；线粒体内的prohibitin可以调节线粒体呼吸酶的组合，可以与线粒体内膜的il—AAA蛋白酶一起被纯化Il3]。Nijtmans等=¨认为prohibitin可以负调节线粒体基质辅助的m—AAA蛋白酶复合物的蛋白降解活性，对新合成的线粒体蛋白有着直接的保护作用：prohibitin也是Ras激活Raf2MEK2ERK信号通路过程中必不可少的因素m真菌中的prohibitin还可以作为直接的线粒体内膜的伴随蛋白，其主要作用是装配呼吸链酶，在变化的线粒体代谢中充当一个“控制酶”的作用。
在紫杉醇耐药的人急性T淋巴细胞白血病(CCRF—CEM／taxo1)细胞中，线粒体prohibitin可以调节呼吸链蛋白的组合，稳定电子传递链；另一方面可以保护线粒体蛋白免受基质辅助的m—AAA蛋白酶复合物的降解，保护线粒体的完整性，抑制紫杉醇诱导的细胞凋亡的发生。
线粒体prohibitin位于线粒体的内膜上，与线粒体的一些活动密切相关，prohibitin高表达，一方面满足磷酸化激活的需要，磷酸化的prohibitin在细胞增殖的调节机制尚不清楚；另一方面线粒体prohibitin可以调节呼吸链酶的组合，稳定电子传递链，还可以直接抑制线粒体内基质辅助的m—AAA酶复合物的蛋白降解活性，保护线粒体内新合成的蛋白，保障线粒体结构的完整性，防止细胞色素c和其他caspases激活蛋白的释放，减少由线粒体导致的细胞凋亡；另外高表达的线粒体prohibitin已可以通过细胞质内的囊泡转运到细胞核或细胞膜，参与细胞核prohibitin的功能，抑制转录因子E2F的转录活性、调节p53基因的稳定性，调节细胞增殖和凋亡之间的平衡，减少细胞凋亡。由此可见，高表达的线粒体prohibitin可以通过多种机制调节细胞，对抗紫杉醇诱导的细胞凋亡，从而在耐药机制中发挥着重要作用。

3总结和展望
化疗耐药严重影响了大多数人类肿瘤的成功治愈。卵巢癌的耐药性非常常见，因此这一问题尤为明显。在过去的几年中我们对药物诱导的细胞凋亡机制的认识有了很大进步，也影响到了我们对化疗敏感性的认识。然而，我们必须明白，没有一种生化通路是单独进行的。虽然我们对这些通路进行了独立的研究，但是研究结果却显示了它们在细胞调节中的复杂的相互作用。例如对Xiap最初的认识，是胱冬肽酶的抑制剂，但是最近的数据显示这一抗凋亡蛋白与一系列的基础细胞生存通路之间存在互相作用，如PI3K／Akt通路。同样，p53肿瘤抑制因子在介导化疗药物诱发的凋亡反应中有重要作用，如今我们发现它本身也受到抗凋亡蛋白如MDMz和Akt的调节。从根本上来说，化疗的成功依赖于我们对这些通路之间相互作用所得到正确的生存或死亡信号的理解。关于这些生化关系的新近的研究结果是令人感兴趣的，但我们也应该知道，我们对这些相互作用发生的精确机制是不完善的。例如，虽然我们发现Akt似乎能削弱顺铂对p53和Xiap的作用，其相关机制却是不明确的。其中一个可能性是在化疗耐药的细胞中，对顺铂特异的移位后修饰是关键性的。例如，在特殊的细胞状态中，p53和Xiap都同时存在，并被26S蛋白酶降解。因此可能Akt通过改变这些普遍存在的通路而影响这些蛋白的稳定性。这些特殊机制的问题将驱动这一领域未来的研究。另外，高级分子机制的发展对于这一努力方向的作用将是至关重要的。未来的几年很可能对确定这些控制发生和维持细胞耐药的精确机制是关键性的，而且很可能发现几种新的方法来克服这个极大的临床问题。